ADN recombinante y terapia génica en la fibrosis quística

La fibrosis quística debería ser un candidato ideal para la terapia génica por lo siguiente: 1) el defecto está en un solo gen, 2) es una condición recesiva, 3)  el principal órgano afectado es el pulmón que es de fácil acceso y  4) su enfermedad progresiva con un fenotipo virtualmente normal al nacimiento, ofreciendo una ventana terapéutica.

La terapia génica se ha venido desarrollando por mas de 20 años, entre estas opciones tenemos a vectores virales en cuyo genoma se ha insertado la secuencia codificante del CFTR y vectores no virales:

 

Vectores virales: Genoma con gen codificante del CFTR

 

A continuación se presentan varias alternativas basados en vectores virales:

tomado de M. Conese 2011

Se presenta un esquema de de como lo vectores virales infectan las células y liberan su genoma con el gen del CFTR

Vectores no virales 

La utilización de liposomas han mostrado resultados contradictorios, en la figura se demuestra como actúan los liposomas que contienen plasmidos que codifican el CFRT  

Los ensayos que han evaluado estos sistemas de liberación se demuestran a continuación en una revisión realizado por T.Lee

referencias
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1134927/
http://www.medri.uniri.hr/~zpetek/nastava/S6%20genska%20terapija/S6.6._cisticna_fibroza_2.pdf
http://www2.massgeneral.org/bbs/gen228_2009_pdfs/Griesenbach%20Gene%20transfer%20to%20the%20lung.pdf
https://www.youtube.com/watch?v=XmIas9Ccrk0

ADN recombinante dentro de la naturaleza

 En la naturaleza también se puede encontrar transgénicos naturales. Un ejemplo se da en determinadas bacterias que incorporan material genético al genoma de su huésped, en este caso Agrobacterium tumefaciens una bacteria gram negativa del suelo que se sabe tiene una relación muy estrecha con los vegetales de millones de años. Agrobacterium tumefaciens es un patógeno de plantas, a quienes induce “malformaciónes” o “tumores”. Estableciendo con la planta una relación genética que obliga a la a fabricar sustancias que sirven de nutrientes para dicha bacteria, así el  tumor es una especie de fábrica para un solo beneficiario, Agrobacterium. La planta libera sustancias (fenoles) por espacios “heridas” dejados por ésta para atraer a la bacteria. Una vez que se encuentra dentro estas “heridas” transfiere a las células vegetales un plásmido (ADN circular extracromosómico bacteriano) para transferir un segmento de ADN conocido como T-DNA o ADN-T, que se integrará al genoma de la planta. Este T-DNA proveniente de Agrobacterium tumefaciens contiene genes tanto reguladores del crecimiento vegetal que van a inducir el desarrollo de los tumores y también contiene genes que van a  codificar enzimas para que la planta  produzca aminoácidos llamados opinas, que son una fuente de energía específica para  Agrobacterium tumefaciens.

http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/transgenese/agrobacterium/agro.htm
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313x.2000.00808.x/pdf

Algoritmo diagóstico

Algoritmos diagnósticos de la FQ

Desde el descubrimiento del gen CFTR se ha venido observando una heterogeneidad en las manifestaciones clínicas de la FQ, desde pacientes que tienen manifestaciones clásicas en la infancia, con un pobre pronóstico y donde el test de cloro en sudor  tiene rangos bien definidos (mayor a 60 mmol/l), hasta pacientes con presentaciones atípicas pero que presentan mutaciones en los genes CFTR y donde las mediciones de cloro en sudor se encuentran en el límite ( menor a 30 mmol/l) o limítrofe  (30– 60 mmol/l). Para éstos se ha encontrado dos algoritmos diagnósticos basados principalmente en test de sudor y análisis de mutaciones del gen CFTR por técnicas moleculares como se presenta aconitnuación:

Algoritmo por test de sudor:

Algoritmo que puede tener un test de subor con valores limitrofes:

 Referencias

http://thorax.bmj.com/content/61/7/627.full

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2985951/ 

 

utilidad de la PCR en el diagnóstico

Dentro de todas las técnicas de análisis genético utilizados, se ejemplifica uno de los métodos comerciales patentados para detectar mutaciones conocidas, basados en PCR:

Cystic Fibrosis Genotyping Assay, Abbott Molecular, es un método de diagnóstico in vitro para el análisis genético de un panel de mutaciones puntuales conocidas del gen CFRT. Esta tecnología combina a la amplificación de secuencias blanco por medio de la PCR con el ensayo de ligar oligonucléotidos (OLA, por sus siglas en inglés) para producir alelos específicos, fragmentos marcados con fluorescencia que son separados por electroforesis capilar, como se puede ver en la figura tomada de Abbott molecular 2013.  

http://www.abbottmolecular.com/us/products/genetics/sequencing/cystic-fibrosis.html

MÉTODOS ALTERNATIVOS DE DIAGNÓSTICO 

Un factor determinante en la frecuencia de las mutaciones del gen CFTR es la etnia; mientras que  los métodos comerciales ofrecen un panel para tamizaje de aproximadamente 25 mutaciones, existen métodos alternativos que amplian esto, por ejemplo ensayos de microarrays, estudios han evaluado el APEX assay (Arrayed Primer EXtension) presentando buenos resultados costo beneficio y con amplitud de detectar hasta 200 mutaciones.

La técnica se basa en un microchip con Primers (oligonucleótidos)

Titulo: Genotyping Microarray for the Detection of More Than 200 CFTR Mutations in Ethnically Diverse Populations

Objetivo: We describe a molecular diagnostic assay, using a new use of the arrayed primer extension (APEX) technology4 able to detect 204 different CFTR mutations that include a large number of mutations detected in non-Caucasians as well as those that are frequent in the Caucasian population and in the U.S. population as a whole.

Muestras : 51 patient or cell line samples with known mutations were evaluated on the chip.

Extracción ADN: ????

Preparación del “template”: PCR gen CTFR

APEX reacción: figura anexa

Visualización: Genorama QuattroImager 003 (Asper Biotech) at 20-_m resolution

 

http://www.journals.elsevierhealth.com/periodicals/jmdi/article/S1525-1578(10)60567-3/fulltext